稀釋涂布平板法的幾個(gè)誤區
發(fā)布時(shí)間：2024-07-24 瀏覽次數：1451
稀釋涂布平板法是一種常見(jiàn)的微生物計數方法，該方法通過(guò)統計平板上的菌落數推測樣品中活菌個(gè)數，其原理是將待測樣品稀釋適當倍數，使樣品中的微生物細胞分散開(kāi)。再取一定量的稀釋液均勻涂布到固體培養基表面。讓分散開(kāi)的單個(gè)細胞繁殖得到一個(gè)菌落。這樣就可以通過(guò)肉眼可見(jiàn)的菌落數推理肉眼不可見(jiàn)的微生物細胞數。
稀釋涂布平板法計數微生物的計算公式為每克樣品中的菌株數=（C÷V)×M，C代表某一稀釋度下平板上生長(cháng)的平均菌落數，V代表涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積，M代表稀釋倍數。學(xué)生對該公式的理解存在多種認知誤區，導致此類(lèi)問(wèn)題得分率低，現結合典型試題進(jìn)行分析。
誤區一 對平均菌落數的理解
公式中的C不一定是所有實(shí)驗所得菌落數的平均值。為增強實(shí)驗說(shuō)服力和減小實(shí)驗誤差，本實(shí)驗應設置對照實(shí)驗和重復實(shí)驗。此實(shí)驗的對照實(shí)驗是將未涂布菌液的培養基放置在相同條件下培養，其目的是排除培養基污染對實(shí)驗結果產(chǎn)生的影響。若空白對照組平板出現菌落,則說(shuō)明空白對照組的平板被污染，進(jìn)而推測實(shí)驗組平板也可能被污染，這種情況不能直接將實(shí)驗組平板的菌落數取平均值，應重新進(jìn)行實(shí)驗，只有空白培養基沒(méi)有出現菌落，實(shí)驗結果才可信。此實(shí)驗的重復實(shí)驗是將同一稀釋度的稀釋液至少涂布3個(gè)平板（一般設置3—5個(gè)平板）。選擇菌落數在30—300的平板計算平均菌落數。若重復實(shí)驗中某個(gè)平板的菌落數與其他差別甚遠，如四個(gè)平板的菌落數分別為42、200、256、234，菌落數42與其他數值差異過(guò)大，說(shuō)明該平板操作過(guò)程有誤，則該菌落數應舍棄。若舍棄后不足三個(gè)平板，不能用菌落數相近的兩個(gè)平板取平均值，應找到原因并重做實(shí)驗。若計算每克樣品中的某種菌株數，則C應代表某一稀釋度下平板上生長(cháng)的符合該菌菌落特征的菌落數的平均值，培養基上其他菌種形成的菌落數不能一并計算在內。如檢測1L待測水樣中的大腸桿菌數目只統計大腸桿菌菌落數的平均值。
誤區二 對稀釋倍數的判定
平板中菌落數過(guò)少會(huì )導致計數誤差過(guò)大，菌落數過(guò)多又會(huì )造成計數困難，為確保有效活菌數的準確測定，應合理設定稀釋倍數。待測樣品中微生物數量越多，所需稀釋倍數越大，而微生物數量越少，所需稀釋倍數越小。如測定土壤中細菌數量，一般選用104、105和106倍稀釋?zhuān)簻y定放線(xiàn)菌數量，一般選用103、104和105倍稀釋?zhuān)粶y定真菌數量，一般選用102、103和104倍稀釋?zhuān)簻y定自來(lái)水中大腸桿菌數量，一般不稀釋?zhuān)苯舆M(jìn)行涂布培養。人教版高中生物教材給出的樣品稀釋的流程示范是將10g土樣加入到90mL無(wú)菌水中得到稀釋10倍的樣液，從稀釋10倍的樣液中取1mL加入到9mL無(wú)菌水中得到稀釋100倍的樣液，依次類(lèi)推。若取6g土樣配制成稀釋10倍的土壤溶液，則土壤占混合液的10%，土壤溶液總量為60mL，應添加54mL的無(wú)菌水。若取1g土樣配制成稀釋100倍的土壤溶液，則土壤占混合液的1%，土壤溶液總量100mL，應添加99mL的無(wú)菌水。
誤區三 對體積與質(zhì)量的單位換算
微生物計算公式中的V代表涂布平板時(shí)所用稀釋液的體積，通常為0.1mL。但若待測樣品中微生物數目較少，接種0.1mL經(jīng)培養后平板上菌落數達不到30?？稍龃蠼臃N量（如接種1mL）。試題中經(jīng)常改變涂布平板時(shí)所用的稀釋液和所求樣品的體積和質(zhì)量，要注意做好單位換算，如1cm3=103μL=1 mL=10L。體積和質(zhì)量的換算公式是體積=質(zhì)量：密度（V=m/p），水的密度是1g/cm3，則質(zhì)量頭1 g的水的體積是1 cm3即1 mL。
誤區四 對統計誤差的分析
從稀釋涂布平板計數的原理分析，運用該方法統計的菌落數往往比活菌的實(shí)際數目低。因為樣品一般不易完全分散成單個(gè)細胞，當兩個(gè)或多個(gè)活細胞連在一起時(shí)。平板上觀(guān)察到的只是一個(gè)菌落，從稀釋涂布平板計數的過(guò)程分析 稀釋倍數是否合適、涂布是否均勻、培養環(huán)境是否能保證微生物正常生長(cháng)、計數是否存在漏計或重復計數等情況都會(huì )影響統計結果。除此之外，還要考慮培養時(shí)間對菌落數目的影響。菌落數目需要每隔一段時(shí)間統計一次，選取菌落數目穩定時(shí)的記錄作為結果，防止因培養時(shí)間不足遺漏菌落的數目。
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