GB 4789.2-2022 菌落總數測定及原始記錄參考模板
發(fā)布時(shí)間：2024-07-19 瀏覽次數：4417
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標準簡(jiǎn)介
現行有效的GB4789.2-2022是在2022年12月30號開(kāi)始實(shí)施，在2022年6月30號發(fā)布的，與2016版相比，此版標準在檢驗程序上沒(méi)有太大的變化，培養基和試劑方面新增了一個(gè)菌落總數測試片。
標準解讀
檢驗菌種類(lèi)：需氧情況下，37℃培養48h，能在普通營(yíng)養瓊脂平板上生長(cháng)的細菌。不含厭氧或微需氧菌、有特殊營(yíng)養要求的以及非嗜中溫的細菌。也不包括真菌，真菌有單獨的檢驗方法。
菌落總測定是用于判定食品被細菌污染的程度和衛生質(zhì)量，反應食品在生產(chǎn)過(guò)程中是否符合衛生要求。
3 設備和材料
除微生物實(shí)驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下：
3.1 恒溫培養箱：36℃±1℃，30℃±1℃。
主要為細菌的培養提供恒定的溫度
36℃是非水產(chǎn)類(lèi)產(chǎn)品的培養溫度，30℃是水產(chǎn)類(lèi)的培養溫度
3.2 冰箱：2℃~5℃。
用于試劑及菌株的保存
3.3 恒溫裝置：48℃±2℃。
用于對已滅菌但未用的固體培養基的保溫（在此標準上指PCA，在大腸菌群標準上指結晶紫中性紅膽鹽瓊脂）
溫度可以在46℃～50℃之間，只要用時(shí)溫度合適就行
2016版水浴裝置：46℃±1℃，2022版修改為恒溫裝置，這就表示還可以用其他的恒溫設備保存，例如恒溫干燥箱。
3.4 天平：感量為0.1g。
稱(chēng)取培養基及樣品稱(chēng)取，需單獨兩個(gè)天平，一個(gè)放準備室，一個(gè)放無(wú)菌室。
3.5 均質(zhì)器。
對待檢試樣液的均質(zhì)，使試樣液的菌含量保持一致，包括勻漿機和拍打式均質(zhì)器，勻漿機涉及到固體非粉末狀樣品，拍打式均質(zhì)器適用于除固體非粉末狀樣品外的樣品
3.6 振蕩器。
與均質(zhì)器作用相仿
3.7 無(wú)菌吸管：1mL(具0.01mL刻度)、10mL(具0.1mL刻度)或微量移液器及吸頭。
用于試液轉移，微量移液器需定期檢定和滅菌，一次性吸頭需濕熱滅菌處理后烘干水分再使用（買(mǎi)一份移液槍能解放雙手喲，就是耗材用得多）
3.8 無(wú)菌錐形瓶：容量250mL、500mL。
盛裝培養基及試樣液，試樣液可用均質(zhì)袋替代
3.9 無(wú)菌培養皿：直徑90mm。
玻璃培養皿滅菌需放入金屬滅菌桶后選用恒溫干燥箱171℃滅菌3小時(shí)及以上，一次性塑料無(wú)菌培養皿拆包裝前需紫外殺菌15min以上（有些玻璃培養皿因材質(zhì)問(wèn)題，用久會(huì )發(fā)黃，不影響使用）
3.10 pH計或pH比色管或精密pH試紙。
僅用于自配培養基的pH調節，商用培養基基本上不需要調節pH值
3.11 放大鏡或/和菌落計數器。
用于培養后的培養基進(jìn)行菌落計數
加一個(gè)試管和配套試管塞（尺寸15*150mm）
用于盛裝9mL稀釋液，試管和試管塞需要濕熱滅菌處理
4 培養基和試劑
4.1 平板計數瓊脂培養基
主要培養基，成分適合細菌進(jìn)行繁殖
如果是檢一批五個(gè)樣品，大概需要9.4gPCA+400mL水滅菌（以五個(gè)樣品兩個(gè)稀釋度二十個(gè)平板+兩個(gè)空白對照計算，每個(gè)平皿倒15-18mL培養基，用到330mL～396mL。倒培養基倒少了需注意保持培養箱的濕度，不然培養基會(huì )裂給你看）
4.2 菌落總數測試片
應符合GB4789.28中平板計數瓊脂培養基質(zhì)量控制要求,且主要營(yíng)養成分與平板計數瓊脂培養基配方一致。
4.3 磷酸鹽緩沖液
成分較無(wú)菌生理鹽水更科學(xué)合理，磷酸鹽可在適宜范圍內調節試樣液本身pH，降低因樣品本身的pH對實(shí)驗造成影響，適用于酸類(lèi)、堿類(lèi)和高鹽類(lèi)樣品的菌落計數。用前需濕熱滅菌121℃持續15min（推薦用）
4.4 無(wú)菌生理鹽水
較磷酸鹽緩沖液優(yōu)勢為更易配制。用前需濕熱滅菌121℃持續15min
如果是檢一批五個(gè)樣品，大概需要稱(chēng)11.9g氯化鈉+1400mL水溶解分裝（以225mL五個(gè)樣品+9mL試管計算，1400mL能配5瓶225mL 0.85%生理鹽水和30管9mL 0.85%生理鹽水稀釋液，能做到-6或-7梯度）磷酸鹽緩沖液同理
5 檢驗程序
菌落總數的檢驗程序見(jiàn)圖1。
6 操作步驟
除樣品外所有操作需要使用的試劑耗材，必須滅菌，設備設施可采用紫外殺菌及75%濃度酒精擦拭后使用
6.1 樣品的稀釋
6.1.1 固體和半固體樣品：稱(chēng)取25g樣品置于盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌均質(zhì)杯內，8000r/min~10000r/min均質(zhì)1min~2min，或放入盛有225mL稀釋液的無(wú)菌均質(zhì)袋中，用拍擊式均質(zhì)器拍打1min~2min，制成1∶10的樣品勻液。
25g樣品：精確到0.1g，偏差25+0.2g，盡量不要偏差太大，可多不可少。
在標準無(wú)規定的情況下，最好按25g稱(chēng)樣進(jìn)行實(shí)驗，這符合GB 4789.1中對抽樣遵循代表性原則。當稱(chēng)樣數量越少，代表性越差。
225mL稀釋液：可使用滅菌后的量筒量取，也可以配制分裝好后滅菌直接用（比滅菌后量取劣勢為水分滅菌易揮發(fā)，導致稀釋液濃度改變）。用哪種可自由選擇，但特殊樣品（酸類(lèi)、堿類(lèi)、高鹽類(lèi)）盡量使用磷酸鹽緩沖液，避免樣品本身pH造成實(shí)驗誤差。
均質(zhì)器拍打：固體樣品可選用均質(zhì)器均質(zhì)，使樣液混勻；速溶類(lèi)樣品可不用均質(zhì)器。
1:10樣品勻液：1mL樣液→9mL試管稀釋液=10mL勻液，樣液加入后可使用無(wú)菌吸管吹打（盡量不用，減少污染），也可搖勻，盡量使液體保持在試管口以下。
6.1.2 液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25mL樣品置盛有225mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無(wú)菌錐形瓶(瓶?jì)阮A置適當數量的無(wú)菌玻璃珠)中，充分混勻，制成1∶10的樣品勻液。
無(wú)菌玻璃珠：用于混勻樣液與緩沖液
6.1.3 用1mL無(wú)菌吸管或微量移液器吸取1∶10樣品勻液1mL，沿管壁緩慢注于盛有9mL稀釋液的無(wú)菌試管中(注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面)，振搖試管或換用1支無(wú)菌吸管反復吹打使其混合均勻，制成1∶100的樣品勻液。
沿管壁緩慢注：可能在管壁殘留細菌，需要震搖試管，將管壁上的試液混合于勻液中。若使用無(wú)菌吸頭，可直接垂直于試管將試液打入稀釋液中，不靠試管壁，吸頭不入液面。
在樣品菌落數范圍未知/無(wú)法通過(guò)以往樣品判斷菌落數范圍時(shí)，應多做幾個(gè)稀釋度。
6.1.4 按6.1.3操作，制備10倍系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋一次，換用1次1mL無(wú)菌吸管或吸頭。
盡量避免稀釋梯度之間的污染
6.1.5 根據對樣品污染狀況的估計，選擇1個(gè)~3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液(液體樣品可包括原液)，在進(jìn)行10倍遞增稀釋時(shí)，吸取1mL樣品勻液于無(wú)菌平皿內，每個(gè)稀釋度做兩個(gè)平皿。同時(shí)，分別吸取1mL空白稀釋液加入兩個(gè)無(wú)菌平皿內作空白對照。
根據以往的樣品大概的菌含量預估樣品的菌含量，適當選擇2個(gè)~3個(gè)稀釋梯度，可以選擇2個(gè)稀釋梯度，但必須有1個(gè)至2個(gè)梯度的菌含量在范圍內
例：-1（皿1 皿2） -2（皿1 皿2） 空白（皿1 皿2）
6.1.6 及時(shí)將15mL~20mL冷卻至46℃~50℃的平板計數瓊脂培養基(可放置于48℃±2℃恒溫裝置如：恒溫水浴箱中保溫)傾注平皿，并轉動(dòng)平皿使其混合均勻。
平板計數瓊脂培養基溫度需適宜，以不燙手為宜（水浴箱中拿出的培養基溫度適中，可直接使用，無(wú)需冷卻）。
有些樣品為避免白色食物殘渣在計數時(shí)的影響，會(huì )在PCA中加入TTC（各大培養基廠(chǎng)商有售無(wú)菌TTC溶液），使培養后的菌落呈紅色。此項適用于食物殘渣中含白色物質(zhì)。
轉動(dòng)平皿使其混合均勻：平皿保持同方向，手拿平皿邊緣按前后運動(dòng)、左右運動(dòng)、順時(shí)針混勻，禁止培養基因大力轉動(dòng)造成溢出，培養基冷凝后方可倒置平皿培養。
本標準未規定稱(chēng)取至倒培養基的過(guò)程時(shí)間，一旦樣品過(guò)多，盡量保持在20min之內。（標準沒(méi)寫(xiě)，GB 4789.3中大腸菌群操作時(shí)間是15min，為的是避免過(guò)程中因時(shí)間過(guò)長(cháng)導致細菌繁殖）
6.2 培養
6.2.1 待瓊脂凝固后，將平板翻轉，36℃±1℃培養48h±2h。水產(chǎn)品30℃±1℃培養72h±3h。如果樣品中可能含有在瓊脂培養基表面彌漫生長(cháng)的菌落時(shí)，可在凝固后的瓊脂表面覆蓋一薄層瓊脂培養基(約4mL)，凝固后翻轉平板，按6.2.1條件進(jìn)行培養。
倒置平皿培養，溫度36℃±1℃，記錄溫度時(shí)需準確，不出現±符號。一般培養箱檢定時(shí)會(huì )提供一個(gè)偏差值，需要在原有溫度基礎上修正偏差量
水產(chǎn)品培養溫度比正常的樣品要低，主要原因是水產(chǎn)品長(cháng)期處于水中，生長(cháng)環(huán)境溫度較低。
6.2.2 如使用菌落總數測試片,應按照測試片所提供的相關(guān)技術(shù)規程操作。
6.3 菌落計數
6.3.1 可用肉眼觀(guān)察，必要時(shí)用放大鏡或菌落計數器，記錄稀釋倍數和相應的菌落數量。菌落計數以菌落形成單位(colony-formingunits，CFU)表示。
CFU指單個(gè)培養皿的菌落個(gè)數。
6.3.2 選取菌落數在30 CFU~300 CFU之間、無(wú)蔓延菌落生長(cháng)的平板計數菌落總數。低于30CFU的平板記錄具體菌落數，大于300CFU的可記錄為多不可計。每個(gè)稀釋度的菌落數應采用兩個(gè)平板的平均數。
6.3.3 其中一個(gè)平板有較大片狀菌落生長(cháng)時(shí)，則不宜采用，而應以無(wú)片狀菌落生長(cháng)的平板作為該稀釋度的菌落數;若片狀菌落不到平板的一半，而其余一半中菌落分布又很均勻，即可計算半個(gè)平板后乘以2，代表一個(gè)平板菌落數。
6.3.4 當平板上出現菌落間無(wú)明顯界線(xiàn)的鏈狀生長(cháng)時(shí)，則將每條單鏈作為一個(gè)菌落計數。
7 結果與報告
7.1 菌落總數的計算方法
7.1.1 若只有一個(gè)稀釋度平板上的菌落數在適宜計數范圍內，計算兩個(gè)平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應稀釋倍數，作為每g(mL)樣品中菌落總數結果。
7.1.2 若有兩個(gè)連續稀釋度的平板菌落數在適宜計數范圍內時(shí)，按式(1)計算：
7.1.4 若所有稀釋度的平板菌落數均＜30CFU,則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
7.1.3 若所有稀釋度的平板上菌落數均＞300CFU,則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數,其他平板可記錄為多不可計,結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。
7.1.5 若所有稀釋度(包括液體樣品原液)平板均無(wú)菌落生長(cháng),則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。
7.1.6 若所有稀釋度的平板菌落數均不在30CFU~300CFU 之間,其中一部分＜30CFU 或＞300CFU 時(shí),則以最接近30CFU或300CFU的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。
7.2 菌落總數的報告
7.2.1 菌落數小于100CFU 時(shí),按“四舍五入”原則修約,以整數報告。
菌落數指計算后的結果，即公式（1）中的N
例如計算結果為35CFU/(g)mL，則報35CFU/(g)mL，不需要再修約。
7.2.2 菌落數大于或等于100CFU 時(shí),第3位數字采用“四舍五入”原則修約后,取前2位數字,后面用 0代替位數;也可用10的指數形式來(lái)表示,按“四舍五入”原則修約后,采用兩位有效數字。
例如計算結果為3540，則報3500CFU/(g)mL或3.5×103CFU/(g)mL
7.2.3 若空白對照上有菌落生長(cháng),則此次檢測結果無(wú)效。
空白對照長(cháng)菌，證明環(huán)境/試劑/工具有污染。
此條可理解為當空白對照沒(méi)長(cháng)菌落時(shí)，可以用“未檢出”表示
7.2.4 稱(chēng)重取樣以 CFU/g為單位報告,體積取樣以 CFU/mL為單位報告。
附錄A
培養基和試劑
A.1 平板計數瓊脂(platecountagar,PCA)培養基
A.1.2 制法
將上述成分加于蒸餾水中,煮沸溶解,調節 pH 至7.0±0.2。分裝試管或錐形瓶,121 ℃高壓滅菌 15min。
有商品化脫水培養基，不用自行調節pH，可直接使用，有效避免自配產(chǎn)生的誤差。
其中樣品為白色或偏白色時(shí)，培養基中可添加1%的無(wú)菌TTC進(jìn)行菌落著(zhù)色，著(zhù)色后菌落為紅色。
煮沸溶解：適用于自配培養基，商品化脫水培養基可不進(jìn)行此操作（滅菌前需分裝的培養基除外）
A.2 磷酸鹽緩沖液
貯存液：稱(chēng)取34.0g的磷酸二氫鉀溶于500mL蒸餾水中,用大約175mL的1mol/L氫氧化鈉溶 液調節pH 至7.2,用蒸餾水稀釋至1000mL后貯存于冰箱。
A.2.2 制法
稀釋液：取貯存液1.25 mL,用蒸餾水稀釋至1000mL，分裝于適宜容器中，121 ℃高壓滅菌15min。
有商品化脫水培養基，直接使用，有效避免自配產(chǎn)生的誤差。
A.3 無(wú)菌生理鹽水
A.3.2 制法
稱(chēng)取8.5g氯化鈉溶于1000mL蒸餾水中，121 ℃高壓滅菌15min。
菌落總數原始記錄參考模板
參考資料：
1. GB 4789.2-2022 食品安全國家標準 食品微生物學(xué)檢驗 菌落總數測定
2.中華人民共和國衛生健康委員會(huì )官網(wǎng)
3.T/LZZLXH 033-2020 實(shí)驗室產(chǎn)品檢測全流程記錄管理指南
4.DB51/T 2163-2016 實(shí)驗室樣品記錄及檢測記錄管理指南
5.微生物檢驗方法食品安全國家標準實(shí)操指南
6.《寒煙脆》公眾號文章（2022年4月30日）
