ddRFC:一種可擴展的多重液滴數字化核酸擴增檢測平臺
發(fā)布時(shí)間：2024-07-31 瀏覽次數：201
數字化核酸擴增檢測（Digital nucleic acid amplification tests，dNAATs）因其高靈敏度和高特異性，已成為一種流行的核酸檢測工具。然而，現有的大多數dNAATs平臺都依托于“單色單靶標”的檢測策略，這樣的方法面臨著(zhù)光譜重疊的問(wèn)題，且靶標檢測重數受限于觀(guān)測設備的熒光通道數目。為擴展dNNATs的多重檢測能力，約翰霍普金斯大學(xué)的Tza-Huei Wang團隊開(kāi)發(fā)了一個(gè)多重液滴數字化核酸擴增檢測平臺，名為ddRFC（Droplet Digital Ratiometric Fluorescence Coding），該研究成果于2020年發(fā)表在《Biosensors and Bioelectronics》上。
dNAATs是一種在大量體積為fL到μL的反應單元中定量目標核酸分子的絕對定量方法?；谖⒘骺匕l(fā)展的dNAATs具有下列優(yōu)勢：1）試樣量消耗少；2）靈敏度高。相較于基于毫升體積的NAATs，微小的反應單元大大增加了目標分子的局部濃度，降低了體系中存在的反應抑制劑和多重反應體系中存在的競爭底物的干擾效應，由此提高了整體的檢測靈敏度和特異性。也正因為此，dNAATs越來(lái)越多地應用于病原鑒定，遺傳疾病篩查和癌癥診斷等領(lǐng)域。然而，目前大多數dNAATs平臺都存在多重檢測能力不足以滿(mǎn)足感染性疾病“多靶標齊篩選”的問(wèn)題。這些平臺大多基于“單色單靶標”的檢測策略，這使得方法的多路復用能力受限于檢測設備可用的熒光通道的數量（≤6）。然而，為了避免光譜重疊問(wèn)題，并考慮到成本造價(jià)，大多數商用的dNAATs設備，例如BioRad ddPCR?和QuantStudio? (Thermo Fisher)僅有2個(gè)熒光通道。為擴展dNAATs的多重檢測能力，已有科研人員提出用熒光強度編碼目標核酸來(lái)避免“單色單靶標”面臨的挑戰，盡管此方案可以在現有的2色檢測器的范圍內工作，但這種策略需要大量實(shí)驗來(lái)優(yōu)化引物/探針集的濃度，以平衡擴增效率、特異性以及競爭動(dòng)力學(xué)?；诖搜芯勘尘?，Tza-Huei Wang課題組提出了一個(gè)液滴數字化熒光比率編碼（ddRFC）的多重dNAATs策略，反應原理可以概括為：通過(guò)在靶標特異性鎖式探針上結合不同比率的兩種顏色的分子信標，將其作為待檢靶標的編碼，形成液滴后進(jìn)行HRCA反應，觀(guān)測每個(gè)液滴的雙色熒光信號強度，實(shí)現相應目標分子的多重定量。
研究所用的鎖式探針包括3個(gè)部分：與靶標序列互補的2個(gè)末端；熒光編碼區域（分子信標結合位點(diǎn)）以及HRCA通用引物結合位點(diǎn)。作者設計了6種靶標特異性鎖式探針（僅使用2個(gè)不同熒光基團的分子信標），分別用于6種性傳播病毒的檢測：MG，HSV，NG，HIV，TP，CT，其對應的R/G編碼分別為：0:1；1:4；1:1；2:1；4:1；1:0。其實(shí)驗流程可以概述為：①將6種線(xiàn)型鎖式探針和待檢DNA混合樣本于55℃下孵育1h；②探針與對應靶標結合后，線(xiàn)型則會(huì )轉變成環(huán)狀。向反應體系中加入HRCA通用引物和分子信標混合后形成3 pL液滴，收集于離心管中并于60℃孵育2 h，進(jìn)行HRCA反應。隨后95℃，5 min使酶失活，37℃ 20min使得分子信標結合到鎖式探針結合位點(diǎn)上。③液滴注入檢測通道，通過(guò)設計的系統測定熒光強度，MATLAB處理數據（圖1）。
圖1 ddRFC檢測6種性傳播病毒的設計原理（A-B）和實(shí)驗流程（C）
作者首先利用合成的6種病毒的寡核苷酸進(jìn)行了單重能力驗證，結果顯示液滴的相對熒光強度與設定的R/G值具有很好的相關(guān)性（圖2A）。作者也繪制了每種設定R/G值下的陽(yáng)性液滴的紅色和綠色熒光強度的二維散點(diǎn)圖，如圖2B，可以觀(guān)察到6個(gè)分離良好的種群，且測得的R/G值與設定值存在良好的線(xiàn)性關(guān)系（圖2C），由此證明了方法的可行性。隨后，作者展開(kāi)了二重、四重乃至六重實(shí)驗，根據所得的散點(diǎn)圖，證明了方法的多重檢測能力（圖3）。
圖2 （A）LIF系統記錄的每個(gè)液滴的紅色和綠色熒光時(shí)間軌跡；（B）6個(gè)樣本的紅色和綠色熒光強度二維散點(diǎn)圖；（C）測量的R/G平均值與設計的R/G值的線(xiàn)性相關(guān)性，每個(gè)樣本至少統計1000個(gè)陽(yáng)性液滴。
圖3 ddRFC的多重檢測能力驗證，所用的模板全是合成的寡核苷酸。（A）NG和HIV混合樣本檢測結果中各至少1000個(gè)陽(yáng)性液滴的紅色和綠色熒光強度的二維散點(diǎn)圖；（B）HIV與NG比值的測量值與理論值之間的線(xiàn)性關(guān)系（R2=0.9995，n=3）；（C）NG、HIV、CT和MG混合樣本檢測結果中各至少1000個(gè)陽(yáng)性液滴的紅色和綠色熒光強度的二維散點(diǎn)圖；（D）NG、HIV、CT、MG、CT和HSV混合樣本檢測結果中各至少1000個(gè)陽(yáng)性液滴的紅色和綠色熒光強度的二維散點(diǎn)圖。
總的來(lái)說(shuō)，該團隊發(fā)展的ddRFC具有以下創(chuàng )新性?xún)?yōu)勢：1）利用成環(huán)鎖式探針為每個(gè)目標基因分配了預先設計的熒光強度比值，消除了“單色單靶標”存在的光譜重疊的影響問(wèn)題；2）僅用2個(gè)標準熒光基團即可實(shí)現6種性傳播病毒的檢測，具有較強的多重可擴展能力；3）只需改變分子信標結合位點(diǎn)的數量，無(wú)需改變HRCA的引物和更換分子信標，經(jīng)濟高效。不過(guò)，本文中該方法在定量能力和實(shí)際臨床樣本上確無(wú)過(guò)多體現。但是，隨著(zhù)進(jìn)一步的改進(jìn)和發(fā)展，ddRFC仍有很大潛力成為大規模多重核酸檢測的強大的dNAATs平臺，作為未來(lái)更多疾病的診斷工具。
原文鏈接：https://doi.org/10.1016/j.bios.2020.112499
來(lái)源：微生物安全與健康網(wǎng)
鏈接：https://www.mbiosh.com/column/testing-technology/testing-technology-method/28023
