人源諾如病毒（HuNoVs）是導致急性胃腸炎的主要病原體。由于缺乏合適的培養系統，HuNoVs的發(fā)病機制以及疫苗和藥物的開(kāi)發(fā)進(jìn)展緩慢。雖然研究人員在上個(gè)世紀采用了多種方法在體外培養HuNoVs（圖1），但病毒無(wú)法穩定增殖、病毒滴度低、重復試驗不穩定等問(wèn)題仍然不可忽視。
圖1 諾如病毒體外培養方法[1]
背景介紹
諾如病毒可分為10個(gè)基因群（genogroups）和48個(gè)基因型（genotypes），而與人類(lèi)感染相關(guān)的有五個(gè)基因群：GI、GII、GIV、GVIII和GIX。全球50%的諾如病毒疫情與GII.4基因型相關(guān)，自1990年代以來(lái)，該基因型的病毒株導致了六次大流行。在2014年冬季，GII.17在亞洲出現，逃逸了群體免疫，引發(fā)了中國和日本的廣泛爆發(fā)，并在某些地區取代了GII.4。近年來(lái)，非GII.4病毒如GII.2和GII.3也在多個(gè)國家引發(fā)大規模疫情。
腸道上皮細胞系
腸道上皮細胞是HuNoVs從粘膜表面侵入內部時(shí)首先接觸到的細胞類(lèi)型。在陽(yáng)性患者的近端小腸活檢中觀(guān)察到的病理特征包括絨毛縮短、黏膜炎癥以及腸道上皮細胞出現空泡化現象，伴有微絨毛縮短。此外，對一名急性HuNoVGII.4悉尼毒株腹瀉的兒科腸移植患者不同部位的腸道活檢組織進(jìn)行分析發(fā)現，人類(lèi)諾如病毒靶向腸內分泌細胞（EECs），這是一種具有感覺(jué)和內分泌功能的特化上皮細胞。這些跡象表明腸道上皮細胞與HuNoV感染過(guò)程密切相關(guān)，因此研究人員最初試圖在腸道上皮細胞中培養HuNoVs。
White等人特意將放射性標記的重組諾如病毒病毒樣顆粒VLPs結合到13種不同的細胞系上，發(fā)現分化的人結腸癌細胞（Caco-2）與 VLPs的結合最多，顯著(zhù)高于未分化的Caco-2細胞和其他細胞。與此同時(shí)，當Duizer等人嘗試將HuNoVs接種到包括Caco-2在內的八種人腸道上皮細胞系時(shí)，發(fā)現沒(méi)有一種細胞系能夠實(shí)現顯著(zhù)的基因拷貝數增加或新感染病毒的產(chǎn)生。
抗原呈遞細胞
抗原呈遞細胞（APCs）是一類(lèi)能夠攝取和處理抗原并將其呈遞給T細胞的免疫細胞，包括巨噬細胞（MΦ）、樹(shù)突細胞（DCs）和B細胞。Wobus等人于2003年發(fā)現了第一株小鼠諾如病毒（MNV），并隨后發(fā)現MNV能夠在DCs和MΦ中有效復制，因此建立了諾如病毒的首個(gè)細胞培養系統。盡管小鼠無(wú)法感染HuNoVs，但通過(guò)低劑量注射HuNoV VLPs可以在體內刺激IgG和IgA介導的適應性反應，因此推測HuNoVs在感染宿主后也會(huì )產(chǎn)生細胞適應性免疫反應。Ponterio等VLPs能夠誘導APCs的激活和成熟。然而，當HuNoVs與來(lái)自易感個(gè)體的單核細胞亞群衍生的DCs和MΦ在體外培養時(shí)，發(fā)現部分外周血單核細胞衍生的DCs能夠表達病毒VP1和VPg蛋白，但所有細胞中的病毒RNA拷貝數并未增加；2014年，Jones等人成功將HuNoVs GII.4毒株、MNV-1和MNV-3接種到B細胞系（BJAB細胞系）中，增加了病毒拷貝數并產(chǎn)生了結構/非結構蛋白，進(jìn)一步證明了通過(guò)傳代實(shí)驗產(chǎn)生新感染病毒顆粒的可能性。然而該團隊強調了實(shí)驗成功需要考慮的多種因素；接種液必須是未經(jīng)過(guò)濾的病毒陽(yáng)性糞便上清液，因為腸道微生物的存在是HuNoV感染的重要共同因子。此外，參與的B細胞類(lèi)型（可以在BJAB和Raji細胞中復制，但不能在Namalwa和HuNS1細胞系中復制）、它們的狀態(tài)和密度也會(huì )影響感染的效率，此外還有培養基中胎牛血清的來(lái)源。盡管這個(gè)體外培養系統最初取得了一定成功，但仍然存在一些問(wèn)題。這個(gè)培養系統只能適度增加HuNoV基因組拷貝數，不能產(chǎn)生體內觀(guān)察到的病毒復制水平。
3D細胞聚集體
幾十年來(lái)，HuNoVs的二維單層細胞培養系統一直以失敗或低效率告終。在感染病毒的活體動(dòng)物中，細胞在三維環(huán)境中協(xié)同工作，這種空間環(huán)境可能對病毒或其他傳染病原體的感染至關(guān)重要。
1998年，美國國家航空航天局（NASA）報告了使用旋轉壁反應器（RWV），該反應器模擬微重力和低流體剪切環(huán)境，使得其中培養的細胞能夠形成極性和三維聚集體；這使得能夠有效重建原生組織的結構，并模擬人類(lèi)微環(huán)境。自引入以來(lái)，研究人員使用該反應器培養來(lái)自多個(gè)器官（淋巴、肺、腎、胃、腸、陰道等）的細胞聚集體，并深入探討所涉及病毒的發(fā)病機制。Straub等人應用RWV技術(shù)，成功地在3D人胚小腸上皮（INT 407）聚集體中培養了兩種HuNoV毒株（GI.1和GII.4），并進(jìn)行了多次傳代。感染HuNoVs一天后，細胞聚集體表現出空泡化和微絨毛縮短，從細胞載體上脫落；它們還呈現出細胞病理效應（CPE），細胞形態(tài)變得延長(cháng)或扭曲。隨后，研究團隊在Caco-2的3D聚集體中培養了兩種HuNoV毒株GI.1和GII.4；在感染的聚集體中顯示出2–3 Log10的病毒RNA拷貝數。然而，其他實(shí)驗室在使用相同方法培養3D聚集體的INT 407或Caco-2細胞后，沒(méi)有病毒復制的跡象；不過(guò)觀(guān)察到了細胞分化和頂端絨毛的形成。
人類(lèi)腸道類(lèi)器官（HIE）
2009年Hans Clevers團隊成功地在體外培養了小鼠腸道干細胞，使其在非上皮生態(tài)位中形成具有多種分化細胞類(lèi)型（包括干細胞、腸細胞、杯狀細胞和腸內分泌細胞）的絨毛腸上皮結構域，這些細胞具有長(cháng)時(shí)間生長(cháng)的能力。自那時(shí)以來(lái)，這項技術(shù)迅速發(fā)展，創(chuàng )造了腸道、腦、胃、肺、卵巢等多種類(lèi)型的類(lèi)器官。類(lèi)器官能夠模擬和反映人類(lèi)器官在不同環(huán)境中的狀態(tài)，因此被廣泛應用于病原微生物感染、藥物開(kāi)發(fā)和篩選、再生醫學(xué)和精準醫學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域。
人類(lèi)腸道類(lèi)器官（HIE）包含具有隱窩樣增殖區的腸上皮的主要細胞類(lèi)型。結合上皮單層細胞系的高通量與實(shí)驗動(dòng)物腸道的復雜性，HIE在研究人類(lèi)腸道相關(guān)疾病方面得到了廣泛應用，并為各種病毒的體外培養提供了新的方向
2016年，Mary K. Estes團隊培養了來(lái)源于空腸的單層HIE，系統有效表征了不同亞型HuNoVs的復制（在96小時(shí)后，HuNoV基因組RNA增加了1.5–2.5 log10，感染細胞占35–45%，透射電子顯微鏡下可觀(guān)察到典型的病毒顆粒結構）和傳代（四次連續傳代存在病毒的感染性后代的產(chǎn)生）。研究人員發(fā)現，膽酸等添加劑能夠促進(jìn)GII.3和GII.17兩個(gè)亞型的復制，并促進(jìn)GII.4亞型的復制；這項研究代表了HuNoVs體外培養的重大突破，極大推動(dòng)了對HuNoVs的基礎研究。實(shí)驗結果被多個(gè)國家的實(shí)驗室成功驗證，多種HuNoVs基因型（GI.1、GII.1、GII.2、GII.3、GII.4、GII.6、GII.8、GII.12、GII.14和GII.17）實(shí)現復制。
斑馬魚(yú)模型
斑馬魚(yú)因其發(fā)育透明、易于遺傳操作以及具有與人類(lèi)相似的免疫系統，成為了研究病毒與宿主相互作用的重要模型。在諾如病毒的研究中，科學(xué)家們利用斑馬魚(yú)的胚胎和幼魚(yú)模型發(fā)現，諾如病毒能夠感染斑馬魚(yú)的腸道上皮細胞，通過(guò)模仿人類(lèi)的感染途徑，斑馬魚(yú)模型幫助科學(xué)家解析諾如病毒如何與宿主細胞結合、進(jìn)入細胞以及復制的詳細過(guò)程。
在斑馬魚(yú)幼蟲(chóng)中復制在感染后第天達到峰值，至少可在6天內檢測到。HuNoV GII.4 可以在幼蟲(chóng)之間連續傳代2次?？共《局委熆蓹z測到HuNoV復制減少了>2 log10，表明該模型適用于抗病毒研究。斑馬魚(yú)模型為篩選抗諾如病毒藥物提供了一個(gè)有效的平臺。通過(guò)在感染斑馬魚(yú)中測試不同的化合物，研究人員可以快速評估這些藥物的活性，進(jìn)而為疾病的治療提供新的思路。
參考文獻：[1] Cheng C, Cai X, Li J, Zhang X, Xie Y, Zhang J. In Vitro Culture of Human Norovirus in the Last 20 Years. Biomedicines. 2024, 24;12(11):2442.
來(lái)源：微生物安全與健康網(wǎng)，作者~薛亮。
