科研干貨（菌種復蘇與傳代）| 菌種傳代次數必須在五代以?xún)龋?/h2>
發(fā)布時(shí)間：2024-12-30 瀏覽次數：3206
一、菌種傳代次數：經(jīng)驗值還是理論值？
將菌種的傳代次數控制在5代以?xún)仁且豁?span style="color:#0000ff;">經(jīng)過(guò)長(cháng)期實(shí)踐驗證的經(jīng)驗結論。這一指導原則的確立，旨在避免多次傳代可能導致菌種遺傳特性喪失或者發(fā)生變異。這一變異可能影響其在研究和生產(chǎn)中的穩定性和生物活性。
通過(guò)限制傳代次數至5代以?xún)?，可以有效減少遺傳變異的風(fēng)險，從而確保菌種在實(shí)驗和生產(chǎn)中保持穩定的遺傳特性及生物活性。這不僅提升了實(shí)驗的可靠性，也保障了生產(chǎn)環(huán)節的產(chǎn)品質(zhì)量。嚴格遵循傳代控制要求，不僅是對實(shí)驗結果的一種保障，也是對菌種長(cháng)久穩定利用的責任。因此，這一經(jīng)驗值在許多專(zhuān)業(yè)領(lǐng)域被廣泛認可和應用。
“5代”這一限制既是基于長(cháng)期微生物學(xué)實(shí)踐經(jīng)驗的總結，也具有一定的理論依據。這一傳代次數限制的設立旨在避免由于過(guò)多傳代導致的菌種退化或遺傳變異，從而確保在研究和生產(chǎn)中所使用的菌種保持其穩定的遺傳特性和生物活性。
這一數字并非隨意制定，而是依托大量實(shí)驗數據和實(shí)踐經(jīng)驗，認為5代是一個(gè)合理的上限，能夠有效維持菌種的穩定性和可靠性。在許多生物技術(shù)應用中，遵循這項傳代限制已經(jīng)成為確保實(shí)驗和生產(chǎn)一致性的重要保障。通過(guò)嚴控傳代次數，科學(xué)家可以更大程度地確保結果的可重復性和產(chǎn)品的高質(zhì)量。
二、菌種傳代次數必須在5代以?xún)?？超過(guò)5代是否可行？
根據微生物學(xué)常識，菌種的傳代次數與其遺傳變異率之間存在正相關(guān)關(guān)系：傳代次數越多，變異的風(fēng)險也就越高。雖然技術(shù)上并非完全禁止使用超過(guò)5代的菌種，但在超過(guò)5代后，菌種的穩定性和可靠性可能會(huì )受到挑戰，增加意外問(wèn)題出現的可能性。
只有在經(jīng)過(guò)5代傳代后，經(jīng)過(guò)細致檢查確認菌種的形態(tài)結構、生理生化特性等依然保持不變的情況下，才可考慮繼續使用。但即便如此，多個(gè)傳代在實(shí)驗過(guò)程中仍然被不建議，因為這會(huì )顯著(zhù)增加變異和風(fēng)險的可能性，這在實(shí)驗及生產(chǎn)中被視為一種風(fēng)險行為。因此，嚴格控制菌種傳代在5代以?xún)仁腔谪S富的實(shí)踐經(jīng)驗總結而來(lái)的最佳實(shí)踐方法，以確保實(shí)驗和生產(chǎn)流程在準確性和可靠性上保持不變。堅持這一經(jīng)驗法則不僅是在保證實(shí)驗結果的一致性，更是在規避不必要的研究風(fēng)險。
三、限制傳代次數依據是什么？
根據《中國藥典：2020年版·四部-9203藥品微生物實(shí)驗室質(zhì)量管理指導原則》，該標準規定，工作菌株的傳代次數應嚴格控制在不超過(guò)5代以?xún)取?span style="color:#e74c3c;">起始代數為從菌種保藏機構獲得的標準菌株，計為第0代。這一規定的設置旨在防范多次傳代所可能導致的菌種遺傳變異風(fēng)險。
在具體操作中，一次傳代被定義為將活的培養物接種到新的微生物生長(cháng)培養基中進(jìn)行培養。無(wú)論形式如何，任何轉種操作均被視為一次傳代。為了確保實(shí)驗結果的準確性和可靠性，實(shí)驗室在有必要時(shí)需對工作菌株的特性和純度加以確認。
在實(shí)踐中，標準菌株被視為第0代，而其衍生的標準儲備菌株為第1代，隨后的儲備菌株為第2代（儲備菌株亦可作為工作菌株使用）。這意味著(zhù)，工作菌株的第1代W1實(shí)際上相當于第2代菌株。根據“不超過(guò)5代”的規定，工作菌株可用的傳代代數實(shí)際為W1、W2、W3和W4。在此之后，繼續傳代將會(huì )大大增加菌種發(fā)生變異的幾率，因此不建議進(jìn)行超限傳代。
四、如何妥善保藏菌種？
根據《中國藥典：2020年版·四部-9203藥品微生物實(shí)驗室質(zhì)量管理指導原則》，建議采用低溫冷凍干燥、液氮貯存或超低溫冷凍（低于-30°C）等方法來(lái)保存菌種。這些方法能夠有效延長(cháng)菌種的保存時(shí)間，尤其是低于-70°C的冷凍方式或冷凍干燥技術(shù)。此外，標準儲備菌株可以用于每月或每周一次的轉種，以制備工作菌株。
需要特別注意的是，一旦冷凍菌種被解凍并用于制備工作菌株后，不得再重新冷凍或再次使用原凍存管。這是為了確保菌種的穩定性和純度不會(huì )受到不必要的影響。因此，除了嚴格控制傳代次數在5代以?xún)纫詼p少變異風(fēng)險之外，還必須遵循適當的菌種保存方法，以確保菌種的質(zhì)量和實(shí)驗結果的可靠性。
五、實(shí)際操作中，如何確認是那一代菌種？
①. 在實(shí)際實(shí)驗室環(huán)境中，有些實(shí)驗室對菌種管理極為嚴格，而另一些實(shí)驗室可能顯得較為混亂。由于實(shí)驗的人員頻繁更替和菌種的頻繁使用，有時(shí)會(huì )出現難以追蹤菌種代數的問(wèn)題。面對這種普遍現象，我們只能以收到的菌種作為基礎，將其視為第0代。
②. 當接收到新的菌種時(shí)，我們首先需要進(jìn)行簡(jiǎn)單的形態(tài)學(xué)鑒定以及生理生化特性檢測，以評估菌株的活力。如果這些指標沒(méi)有問(wèn)題，那么該菌種可以被視為F0，即母代菌種。但需要明確的是，這樣的做法并不符合《中國藥典》中規定的標準第0代菌種。
③. 這種方法僅作為臨時(shí)參考，并不適用于嚴格要求的實(shí)驗環(huán)境。為了確保實(shí)驗的穩定性和可靠性，還是應盡力遵循規定的實(shí)驗菌種管理流程，標準化菌種的保存和使用，以避免在傳代過(guò)程中出現更多不確定性。
六、菌種復蘇與傳代
1. 復蘇：在無(wú)菌環(huán)境中打開(kāi)冷凍干燥菌種管，加入適量的培養液。培養液的選擇應根據菌種的特性進(jìn)行，如細菌使用營(yíng)養肉湯，白色念珠菌使用沙堡液體培養基，分枝桿菌使用蘇通綜合液體培養基，而黑曲霉菌則使用麥芽浸膏營(yíng)養肉湯培養基。通過(guò)幾次上下吸吹的方式，使菌種充分融化并分散。之后，將菌種懸液適量滴入含有5.0 mL～10.0 mL相應培養液的試管中，并在適宜溫度下培養至規定時(shí)間。通常條件為36℃±1℃培養18 h～24 h，而黑曲霉菌則需要在30℃±1℃培養42 h～48 h，此過(guò)程產(chǎn)出的是第1代培養物。
2. 傳代至第2代：利用接種環(huán)從第1代培養物中取樣，或直接從冷凍保存的菌種管中取出適量菌液或瓷珠，將其劃線(xiàn)接種于適合的培養基平板。根據不同的菌種，選擇適宜的培養基。例如，細菌使用營(yíng)養瓊脂培養基，白色念珠菌使用沙堡瓊脂培養基，分枝桿菌使用改良羅氏培養基或其他專(zhuān)用復合瓊脂培養基，黑曲霉菌使用麥芽浸膏瓊脂培養基。在適宜溫度下培養至規定時(shí)間，即為第2代培養物。
3. 傳代至第3代：選取第2代培養物中的典型菌落，接種于相應的培養基斜面或平板。培育條件同樣依據菌種進(jìn)行選擇。如需可用：細菌使用營(yíng)養瓊脂斜面，白色念珠菌用沙堡瓊脂斜面，分枝桿菌則用改良羅氏菌培養基或專(zhuān)用復合瓊脂斜面，黑曲霉使用麥芽浸膏瓊脂培養基平板。這一過(guò)程得到第3代培養物。
4. 傳代至第4代：從第3代培養物取樣，接種在合適的培養基斜面，在適宜溫度下培養，直至達到期望的時(shí)間并形成第4代培養物。
5. 傳代記錄：繼續傳至所需代數時(shí)，需在傳代試管上明確標記菌種名稱(chēng)、菌種編號、代數及傳代日期等基本信息，以便追蹤和管理菌種傳代過(guò)程的準確性。
文章來(lái)源：環(huán)凱（官網(wǎng)：huankai.com）轉載于“ Dr實(shí)驗助手 ”公眾號；原作者~ 實(shí)驗軼。
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