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GB4789.15-2016霉菌和酵母計數檢驗及注意事項

發(fā)布時(shí)間：2025-02-08      瀏覽次數：183    分享：

檢驗流程及注意事項

GB4789.15-2016霉菌和酵母計數檢驗及注意事項

? 1、樣品制備

◆ 固體和半固體樣品：稱(chēng)取25g樣品，加入225mL無(wú)菌稀釋液（滅菌蒸餾水或生理鹽水或磷酸緩沖液），充分振搖，或用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min 到2 min，制成1：10的樣品勻液。

◆ 液體樣品：以無(wú)菌吸管吸取25mL樣品至225mL無(wú)菌稀釋液（滅菌蒸餾水或生理鹽水或磷酸緩沖液）的適宜容器內（可在瓶?jì)阮A置適當數量的無(wú)菌玻璃珠）或無(wú)菌均質(zhì)袋中），充分振搖，或用拍擊式均質(zhì)器拍打1 min 到2 min，制成1：10的樣品勻液。

◆ 取1mL 1:10稀釋液注入含有9mL無(wú)菌水的試管中, 另?yè)Q一支1mL無(wú)菌吸管反復吹吸，或在螺旋混合器上混勻，此液為1:100稀釋液。   

? 2、接種及培養

◆ 根據對樣品污染狀況的估計，選擇2個(gè)～3個(gè)適宜稀釋度的樣品勻液（液體樣品可包括原液），在進(jìn)行10倍遞增稀釋的同時(shí)，每個(gè)稀釋度分別吸取1mL樣品勻液于2個(gè)無(wú)菌平皿內。同時(shí)分別取1mL樣品稀釋液加入2個(gè)無(wú)菌平皿作空白對照（用于監測培養基、稀釋液、平皿、吸管及操作環(huán)境保證實(shí)驗的有效性）。

◆ 及時(shí)將 20mL～25mL（用量增加，防止水分過(guò)度蒸發(fā)影響生長(cháng)率）冷卻至46℃的馬鈴薯葡萄糖瓊脂或孟加拉紅瓊脂傾注平皿，并轉動(dòng)平皿使其混合均勻。至水平臺面待培養基完全凝固。

◆ 傾注凝固后，正置平板，28℃±1℃，觀(guān)察并記錄培養至第5d的結果。   

關(guān)于正置培養的討論

1、為水分蒸發(fā)導致蓋子內面產(chǎn)生水珠，影響觀(guān)察，同時(shí)平板邊緣開(kāi)裂

2、孢子飄散導致計數不準

3、孢子污染培養箱   

實(shí)際上在28℃下，平板的水分并不會(huì )蒸發(fā)的十分強烈，而且平板內部冷凝水產(chǎn)生一般是由于較大的溫度波動(dòng)，此時(shí)需要考慮的是培養箱放置房間的溫度控制及培養箱的密封性。平板的開(kāi)裂有兩個(gè)因素，一個(gè)是失水過(guò)多，第二個(gè)是因為平板材料與培養基比熱相差較大（玻璃平皿較容易出現），熱脹冷縮導致的瓊脂塊與平板分離。關(guān)于玻璃平皿還有其他的一些問(wèn)題：因生產(chǎn)廠(chǎng)家的不同及不同廠(chǎng)家的品種參次不齊，玻璃平皿蓋底不和，縫隙較大，風(fēng)機的空氣壓力易導致皿內真菌孢子的脫落，及培養箱污染。因此建議用一次性平皿，同時(shí)對培養間的溫度控制，挑選購買(mǎi)培養箱的時(shí)候注意其密封性。

? 3、培養基的使用（兩種任選一種）

PDA平板 孟加拉紅平板 
PDA平板孟加拉紅平板

◆ 兩種培養基都含有氯霉素，可以抑制細菌的生長(cháng)；

◆ 對氯霉素耐藥的一些細菌在這兩種培養基上也生長(cháng)，可以通過(guò)菌落形態(tài)來(lái)區分，或者通過(guò)染色鏡檢來(lái)判定；

◆ 如果需要分開(kāi)報告霉菌和酵母菌的數量，主要通過(guò)菌落形態(tài)來(lái)區分。 

細菌、酵母菌及霉菌的不同菌落形態(tài) 

◆ 細菌：由于細胞小，形成的菌落較小，較薄、較透明、且有“細膩感”?？僧a(chǎn)生不同色素，菌落可呈現五顏六色且形態(tài)多樣。

◆ 酵母菌：由于細胞較大且不能運動(dòng)，一般菌落比細菌大、厚且透明度差。產(chǎn)生色素較單一，通常乳白色，少數為橙紅色，個(gè)別黑色。

◆ 霉菌：菌落形態(tài)較大，質(zhì)地疏松，外觀(guān)干燥，不透明，呈現蛛網(wǎng)狀、絨毛狀、棉絮狀或氈狀；菌落與培養基間的聯(lián)系緊密，不易挑起，菌落正面與反面、邊緣與中心的顏色和構造常不一致。 

細菌、酵母菌及霉菌在電鏡及顯微鏡下的形態(tài) 

霉菌：細胞構造與酵母菌相似，但外觀(guān)以菌絲體形式存在。

霉菌：細胞構造與酵母菌相似，但外觀(guān)以菌絲體形式存在

酵母菌：細胞通常有球狀、卵圓狀、橢圓狀、柱狀和香腸狀。

酵母菌：細胞通常有球狀、卵圓狀、橢圓狀、柱狀和香腸狀。

? 4、計數

◆ 計算統一稀釋度的兩個(gè)平板菌落數的平均值，再將平均值乘以相應的稀釋倍數。

◆ 若有兩個(gè)稀釋度平板上菌落數均在10-150CFU，則按照 GB4789.2 的相應規定進(jìn)行計數。

◆ 若所有平板上菌落數均大于150CFU，則對稀釋度最高的平板進(jìn)行計數，其他平板可記錄為多不可計，結果按平均菌落數乘以最高稀釋倍數計算。   

◆ 若所有平板上菌落數均小于10CFU，則應按稀釋度最低的平均菌落數乘以稀釋倍數計算。 

◆ 若所有稀釋度（包括液體樣品原液）平板均無(wú)菌落生長(cháng)，則以小于1乘以最低稀釋倍數計算。 

◆ 若所有稀釋度平板的菌落數均不在10-150CFU之間，其中一部分小于10CFU或大于150CFU,則以最接近10或150CFU的平均菌落數乘以稀釋倍數做計算。 

? 5、結果報告

◆ 菌落數按“四舍五入”原則修約。菌落數在10以?xún)葧r(shí)，采用一位有效數字報告；菌落數在10-100之間時(shí)，采用兩位有效數字報告。

◆ 菌落數大于或等于100時(shí)，前3位數字采用“四舍五入”原則修約后，取前2位數字，后面用0代替位數來(lái)表示結果；也可用10的指數形式來(lái)表示，此時(shí)也按“四舍五入”原則修約，采用兩位有效數字。

◆ 若空白對照平板上有菌落出現，則此次檢測結果無(wú)效。   

◆ 稱(chēng)重取樣以CFU/g為單位報告，體積取樣以CFU/mL為單位報告，報告或分別報告霉菌和/或酵母數。

過(guò)程中所用到的培養基項 

貨號名稱(chēng)規格
21050馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA)250g/瓶
CP0010馬鈴薯葡萄糖瓊脂 (PDA)平板90mm×20個(gè)
21010孟加拉紅培養基(虎紅瓊脂)250g/瓶
021010B孟加拉紅 (虎紅)瓊脂平板90mm×20個(gè)
021010P1孟加拉紅培養基（虎紅瓊脂）250g/瓶

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GB4789.15霉菌和酵母計數檢驗

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