微生物菌種保存過(guò)程中常見(jiàn)問(wèn)題
發(fā)布時(shí)間：2024-12-04 瀏覽次數：2297
分離純化后才能獲得單一菌株，單一菌株進(jìn)行菌種保藏才有意義，防止菌種交叉污染和變異，這也是菌種保存的基本原則。
1、菌種保存管能保存霉菌及酵母菌嗎？
答：可以。對于霉菌等真菌需培養7天進(jìn)行保存，而酵母菌需培養三天將孢子洗脫下來(lái)進(jìn)行保存，保存管中的小瓷珠可以作為介質(zhì)來(lái)吸附孢子和菌絲，相當于砂土保存法中砂土作為載體起到的作用。
2、所有的菌都能保存嗎？如果不是的話(huà)，什么樣的菌可以保存？什么樣的菌不可以保存？
答：可以。菌種保存的原理是預防或減緩DNA復制時(shí)自發(fā)突變導致菌種退化，因此要創(chuàng )造代謝不活潑的狀態(tài)，而菌種保存時(shí)使菌種進(jìn)入休眠態(tài)（孢子、芽孢)，并創(chuàng )造干燥、低溫、缺氧、缺營(yíng)養的環(huán)境，創(chuàng )造的環(huán)境越接近此狀態(tài)，所保存的菌種的時(shí)間就越長(cháng)，所以從原理上講，所有菌種都可用這種方法保存，但需要注意的是，苛刻菌（如流感嗜血桿菌、腦膜炎萘瑟氏菌）等特殊細菌保存時(shí)，需-80℃或更低溫度保存，才可以做到更長(cháng)期的保存。
3、能用菌種保存管永/久保存菌株嗎？
答：溫度越低，保藏效果越好。從目前的試驗數據及實(shí)際保存效果來(lái)看，-20℃可保存1-5年，-80℃或液氮中可保存5-10年，不同菌種及不同的保存溫度保存時(shí)間會(huì )有所不同（例如：大腸、沙門(mén)等常規細菌-20℃我們目前可以保存到6年）。但需要注意的是所保存的菌種需每年抽檢進(jìn)行生化特征的鑒定，確定菌株無(wú)變異。
4、菌株保存的是第三代，-80℃保存，再取出來(lái)活化的話(huà)屬于第幾代？
答：保存的是第三代復活出來(lái)后，如果采用平板或肉湯活化相當于轉接了一代，就是第四代了，如果還在瓷珠里的話(huà)就還是原來(lái)的代數。如果是保存在斜面上，這一支斜面一直就是第三代，如果轉接到另一支斜面就是第四代了。傳代原則，菌株活化復蘇不論以任何形式繁殖了一次就算是傳了一代。但如果僅是物理位置的轉移沒(méi)有繁殖就不是傳代，需要注意。
5、剛買(mǎi)回來(lái)的陽(yáng)性菌株是第0代嗎？
答：一般菌株你買(mǎi)回來(lái)的時(shí)候上面都會(huì )寫(xiě)明第幾代，常規來(lái)說(shuō)都是第0代的。像購買(mǎi)的ATCC或CICC的凍干粉都是標記為0代的。
6、菌株傳代保存到瓷珠里一定要挑單菌落嗎？
答：不一定非挑單菌落，但是一定要挑相同特征的菌落，就是說(shuō)從同一個(gè)菌落純化出來(lái)的，以保證它們的特性完全一致。原則是盡量多挑，寧多勿少。
7、怎樣延長(cháng)菌株的保存時(shí)間呢？
答：大量的實(shí)驗證明菌株在低溫、干燥、缺氧、缺營(yíng)養的條件下保存效果是最/好的，越接近這種保存條件，菌株的保存時(shí)間越長(cháng)。
8、怎樣純化菌株？
答：純化就是從TSA上或別的非選擇性平板上轉接一次，這就相當于純化了。
9、我們保存的一代菌株是不是要重新傳代保存呢，認證老師會(huì )不會(huì )認為這是個(gè)錯誤？
答：應該不會(huì )，認證老師不會(huì )提出這種問(wèn)題的，不過(guò)最好是一代菌株保存一些、二代菌株保存一些，使用時(shí)工作菌株最好使用第三代菌株，一代菌株可作為長(cháng)期保存用。
10、為何要將第三代作為工作菌株？
答：多傳代幾次后菌株的活力會(huì )明顯提高，但最多傳代到第五代后就不能用了，因為第五代后菌株雖然不會(huì )完全變異，但變異率會(huì )明顯增加，因此選用第三代作為工作菌株是比較合適的，若使用第一、第二代菌株活力沒(méi)有那么強。
11、用瓷珠管反復上下?lián)u勻，有泡沫不容易吸出來(lái)，怎么辦？
答：不必特別劇烈大尺度的搖動(dòng)瓷珠管，稍微上下晃動(dòng)就可以；如果確實(shí)有泡沫的話(huà)可以靜置一會(huì )，讓菌株多吸附一下瓷珠也是可以的。
12、TSA斜面一般多少度保存，可以放在冷藏里嗎？
答：2-8℃保存，放在冷藏是可以的；注意弧菌和綠膿桿菌要放到室溫20-25℃保存，否則會(huì )很快死亡。
13、如果TSA斜面放在冷凍里面，會(huì )有什么影響？
答：瓊脂冷凍后性狀會(huì )發(fā)生改變，會(huì )變得很軟，結構發(fā)生改變，所以不建議冷凍；如果要冷凍的話(huà)就采用甘油保存法或瓷珠保存法。
14、用瓷珠管保存產(chǎn)氣莢膜梭菌老是保存不好！做好瓷珠管之后瓷珠管要放到厭氧袋里面再放到-20℃么？
答：如果冷凍保存最好放在厭氧袋里再-20°保存，保存效果還可以；或者可以采用庖肉培養基保存，它是一種液體培養基，將產(chǎn)氣莢膜梭菌接進(jìn)去然后2-8℃保存，可以保存一年沒(méi)有問(wèn)題，在厭氧環(huán)境下保存效果最好。
15、菌種保藏時(shí)為什么要進(jìn)行分離純化？
答：分離純化后才能獲得單一菌株，單一菌株進(jìn)行菌種保藏才有意義，防止菌種交叉污染和變異，這也是菌種保存的基本原則。
16、菌種保存管對于平板來(lái)說(shuō)，對挑選菌落個(gè)數有要求嗎？還是將整個(gè)平板的菌落全部刮入管中？
答：對于要保存的細菌一般是要進(jìn)行2-3次的純化，要保證一個(gè)平板上的菌是由單一菌落傳代而來(lái)的，所以在細菌保存的過(guò)程中，為了保證制備的菌懸液可以達到3-4MCF，是可以將整個(gè)平板的的細菌全部刮到管中的，如果平板長(cháng)的比較滿(mǎn)一般半個(gè)平板就夠用，具體用量也根據菌種的不同有所差異，如霉菌、酵母菌在保存時(shí)，不適合用濁度法。
17、對于液體培養基培養的純菌，是否也可以用咱們的菌種保存管？如果可以的話(huà)，怎么操作？
答：是可以用的，如果液體培養基能保證是純菌的話(huà)，可以直接離心，棄掉上清，然后把保存管中液體吸進(jìn)去充分混勻，然后再轉移到菌種保存管中，整個(gè)過(guò)程要注意無(wú)菌操作。不過(guò)，一般菌種保存管最好選擇平板菌落進(jìn)行保存，因為液體培養基中有雜菌是不易觀(guān)察出來(lái)的。
18、為什么在菌種保存時(shí)，要上下顛倒？為什么不能旋搖？
答：上下顛倒，可使菌懸液充分混勻，菌株充分、均勻地吸附到小瓷珠上，旋搖不利于菌懸液充分混勻，反而會(huì )使菌株全部沉淀于管底。
19、為什么在使用時(shí)要將管內的液體盡可能多的吸出？
答：吸出液體可避免反復凍融形成的冰晶對菌株的損傷，加快復蘇的過(guò)程，因此，要盡可能的將與菌種混勻后的保存液吸凈。而常用的甘油法，在復蘇的過(guò)程中需用水浴鍋快速溶解，在此過(guò)程中，對菌株傷害較大。
20、在使用后，菌種保存管的保存環(huán)境？需要-80℃冰箱嗎？
答：大部分菌種保存管采用的是低溫冷凍保存法，因此，使用后，需放置低溫環(huán)境，如-20℃、-80℃或液氮中保存，而且溫度越低，保存效果越好。用戶(hù)需根據菌種的保存要求選擇具體保存溫度。
21、為什么說(shuō)，如果有條件的話(huà)，菌種保存管最好置于-80冰箱或液氮中？
答：因為，貯存在-70℃以下低溫中能減少冰晶形成，可極大降低冰晶形成對細菌的傷害，同時(shí)可為被保存的菌種創(chuàng )造更低的代謝環(huán)境，從而延長(cháng)細菌保存的時(shí)間。
22、菌株保存是-70℃還是-80℃有具體標準規定么？
答：其實(shí)是有標準的，《SN/T2632-2010微生物菌株常規保藏技術(shù)規程》是關(guān)于菌株保藏的一個(gè)標準，大家可以學(xué)習一下，各個(gè)保存方式都有介紹，但是瓷珠是比較新興的保存方式暫時(shí)里面還沒(méi)有收錄。
23、為什么在取用菌株時(shí)，操作過(guò)程要求快速？
答：菌種保存復蘇的原則，要求慢凍快融，之所以要求快速，是因為在菌種復蘇的過(guò)程中，長(cháng)時(shí)間的溶解過(guò)程會(huì )對所保存的菌種造成損傷，而我們經(jīng)過(guò)改良的保存方法最/大程度的避免復蘇所造成的影響，但我們還是建議遵循菌種的保存復蘇原則，保證所復蘇菌種的復蘇率。
24、將菌株反復凍存，到底對菌株有什么影響？
答：低溫會(huì )使菌株細胞內的水分形成冰晶，從而引起細胞結構尤其是細胞膜的損傷。細胞體積大者一般要比較小者對低溫更為敏感，而無(wú)細胞壁者則比有細胞壁者敏感。如果放到低溫（不是一般冰箱）進(jìn)行冷凍時(shí)，會(huì )產(chǎn)生冰晶，冰晶呈針狀，極易導致細菌的嚴重損傷。用電鏡觀(guān)察，可見(jiàn)細菌的核膜上有大量針尖樣小孔，當從低溫下移出并開(kāi)始升溫時(shí)，冰晶又會(huì )變大，故反復凍存，會(huì )對菌株造成極大損傷。
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