菌種保藏中的細菌鑒定-廣東環(huán)凱微生物

菌種保藏中的細菌鑒定

發(fā)布時(shí)間：2014-07-03 瀏覽次數：8240 分享：

細菌鑒定是指將分離培養獲得的病原菌,通過(guò)純化培養使其達到不含有其他微生物的純培養程度,繼而進(jìn)行系統鑒定。而菌種保藏機構在收集一些已經(jīng)凍干的菌種時(shí),應在開(kāi)啟后經(jīng)過(guò)兩代的適應性培養方可進(jìn)行復核性的系統鑒定。系統鑒定是通過(guò)細菌的形態(tài)結構、生長(cháng)特性、抗原性、病原性以及目前流行的核酸測定方法等檢測,并用已知標準免疫血清確定分離細菌的屬、種和型(群).目前菌種保藏機構通常使用的細菌鑒定方法大致有以下幾種：

傳統方法

常規宏觀(guān)菌落形態(tài)學(xué)觀(guān)察,主要觀(guān)察菌落在其適合的培養基上的生長(cháng)狀況:細菌在固體培養基上的生長(cháng)形態(tài)、大小、顏色是否均勻一致,菌落個(gè)體表面及邊緣的生長(cháng)狀況;在液體培養基上的渾濁狀況、沉淀狀況、液面菌膜狀況;半固體上穿刺接種后,觀(guān)察細菌是否沿著(zhù)接種線(xiàn)生長(cháng)以及其生長(cháng)狀態(tài)是呈毛刷樣生長(cháng)還是均勻生長(cháng),上下生長(cháng)是否一致.在鑒別培養基上培養,觀(guān)察結果是否跟預期結果相同。

細菌的個(gè)體形態(tài)學(xué)觀(guān)察,即通過(guò)顯微鏡觀(guān)察.觀(guān)察前細菌需要著(zhù)色,要根據預先確定的觀(guān)察項目選擇與之相對應的染色方法,目前常用的染色方法包括革蘭氏染色法、美藍染色法、Ziehl—Neelsen染色法、姬姆薩染色法、鞭毛染色法、芽胞染色法等.盡量挑選對數生長(cháng)期的細菌進(jìn)行染色觀(guān)察,此時(shí)的細菌生長(cháng)處于幼期,利于觀(guān)察,因為一些陳舊細菌的染色結果會(huì )有變化,如本為革蘭氏陽(yáng)性菌經(jīng)過(guò)長(cháng)期擱置后染色結果可能為革蘭氏陰性.同時(shí)細菌培養時(shí)要注意培養基的挑選,一些細菌的特殊結構如莢膜、鞭毛、菌毛、芽胞等,其表達是需要在特定的培養基上才能正常發(fā)育,有的細菌如炭疽在一般的培養基上不形成莢膜,只在動(dòng)物體內形成明顯的莢膜,所以需先接種實(shí)驗動(dòng)物后用病料進(jìn)行涂片鏡檢.在鏡檢時(shí)觀(guān)察細菌基本形態(tài)結構和大小及其排列狀態(tài)、菌端形狀、有無(wú)兩極染色、有無(wú)形成芽胞和莢胞等。

形態(tài)學(xué)鑒定輔以生化試驗在細菌鑒定中具有重要的意義,生化試驗是根據細菌培養過(guò)程中不同菌種所產(chǎn)生的新陳代謝產(chǎn)物各異,表現出不同的生長(cháng)特性.通過(guò)生物化學(xué)的方法來(lái)檢測這些物質(zhì)的存在與否,從而能夠得到細菌的鑒定結果.如糖(醇)類(lèi)代謝試驗、氨基酸和蛋白質(zhì)代謝試驗、有機酸鹽和胺鹽利用試驗、呼吸酶類(lèi)試驗、毒性酶類(lèi)試驗等。

血清型鑒定是根據細菌具有相對特異性的抗原結構這個(gè)特點(diǎn)進(jìn)行微生物鑒定的特異方法.抗原的特異性程度又存在于屬間細菌所共有的共同抗原,這種抗原的存在,能表明其屬性。另一類(lèi)特異性抗原只存在于特定的種、型,是確定細菌種、型的重要依據，通過(guò)專(zhuān)門(mén)的分型血清即可對這些細菌的血清型進(jìn)行鑒定。

細菌毒力的測定,病原菌侵入機體能否引起疾病與其本身的毒力、侵入機體的數量和侵入部位有關(guān).不同的病原菌或同種細菌不同的型或株,毒力常不一致.常用LD50或ID50表示毒力,即在一定時(shí)間內,能使一定條件的某種動(dòng)物半數死亡或感染需要的最小細菌數或毒素量.毒力測定在菌種鑒定過(guò)程中可用于鑒別一些有代表性的菌株.LD50可用Reed—Muench公式進(jìn)行計算。

儀器自動(dòng)化鑒定

隨著(zhù)儀器分析技術(shù)的進(jìn)步和計算機的廣泛應用,微生物菌種鑒定逐漸由傳統的形態(tài)學(xué)觀(guān)察和人工生理生化實(shí)驗鑒定發(fā)展進(jìn)入了基于儀器自動(dòng)化分析的鑒定系統階段。近年來(lái),一系列自動(dòng)鑒定系統相繼推出,并在應用中取得理想效果,如VITEK系統、MIDl系統、BIOLOG系統、SENSITl.TRE系統、AUTOSCEPTOR系統以及MICROSCAN系統等。

以BIOLOG微生物鑒定系統為例,簡(jiǎn)述微生物自動(dòng)鑒定系統的工作原理：BIOLOG微生物自動(dòng)分析系統是一套微生物鑒定系統,該系統主要根據細菌對糖、醇、酸、醋、胺和大分子聚合物等95種碳源的利用情況進(jìn)行鑒定.細菌利用碳源進(jìn)行呼吸時(shí),會(huì )將四哇類(lèi)氧化還原染色劑(TV)從無(wú)色還原成紫色,從而在鑒定微平板(96孔板)上形成該菌株特征性的反應模式或“指紋圖譜”,通過(guò)纖維光學(xué)讀取設備——讀數儀來(lái)讀取顏色變化(分為“自動(dòng)”和“人工”兩種讀取方式),由計算機通過(guò)概率最大模擬法將該反應模式或“指紋圖譜”與數據庫相比較,可以在瞬間得到鑒定結果,確定所分析的菌株的屬名或種名.以BIOLOG系統6.01版數據庫為例,包含了革蘭氏陰性好氧菌524種、革蘭氏陽(yáng)性好氣菌341種、厭氧菌361種、酵母菌267種、絲狀真菌(含部分酵母菌)619種以及幾種特殊的致病菌,目前這個(gè)數據庫已進(jìn)行更新.利用微生物快速系統進(jìn)行細菌鑒定,能節省時(shí)間,但由于其在數據比對過(guò)程中記入一些非特異性的陽(yáng)性反應孔,會(huì )造成偶然誤差,從而引起個(gè)別鑒定結果不穩定,另外此類(lèi)儀器本身及其耗材價(jià)格均較高。

分子生物學(xué)鑒定

分子生物學(xué)鑒定目前比較流行的主要是核酸檢測技術(shù),包括基因測序、指紋圖譜技術(shù)、基因探針技術(shù)、聚合酶鏈反應(PCR)、GC含量測定等.PCR和核酸雜交單獨或結合在儀器已經(jīng)形成比較經(jīng)典的核酸檢測技術(shù),目前這兩者已經(jīng)得到了較大范圍的推廣和應用。

核酸檢測技術(shù)原理DNA的G+C含量測定法

這種方法是根據細菌的DNA中G+C含量的特異性來(lái)進(jìn)行細菌鑒定,通過(guò)熔解溫度(Tm)法或浮力密度法測定細菌DNA中G+C的含量,通過(guò)對比來(lái)鑒定細菌。

16S rRNA鑒定>

細菌的核糖體RNA(rRNA)基因高度保守且進(jìn)化速度緩慢,在漫長(cháng)的進(jìn)化過(guò)程中保留了rRNA基因結構和功能的同源性,在微生物染色體上可存在多個(gè)拷貝,以rRNA基因片段為探針可檢出含有rRNA基因的DNA片段.分析雜交后得到的rRNA指紋圖,為菌種定型和近緣菌株的鑒定提供了一種新技術(shù).針對rRNA基因的核糖體分型可成功地區分多個(gè)菌種的相關(guān)菌株,因此該技術(shù)也被廣泛稱(chēng)作核糖體分型技術(shù).原核生物含有23S、16S和5S三種 rRNA,其大小分別約為3000、1500和120個(gè)堿基.其中作為小亞單位核糖體RNA的16S rRNA的大小最適合于核糖體分型.一般完成l6S rRNA序列測定后,在GenBank中與已知的序列進(jìn)行BLAST分析,從而得出鑒定結果。

擴增片段長(cháng)度多態(tài)性(AFLP)分析

這是一種測定基因組限制性片段的DNA指紋技術(shù),通過(guò)PCR選擇性地擴增整個(gè)基因組DNA的內切酶片段,在分辨率高的聚丙烯酰氨凝膠上電泳,產(chǎn)生一組特異的DNA限制性片段的指紋圖譜.與其他DNA指紋技術(shù)相比有其獨特的優(yōu)點(diǎn):可用于各種大小不同的基因組的指紋分析,為研究細菌屬乃至株間的親緣關(guān)系提供一個(gè)有效手段;具有一定的靈活性,可通過(guò)特異性PCR引物的設計和內切酶組合的選擇,調整AFLP圖譜中限制性片段的適宜數目;由于適用了嚴格的PCR條件和高分辨率的聚丙烯酰氨凝膠電泳,因而重復性好,分辨率高;AFLP不僅僅是簡(jiǎn)單的指紋技術(shù),而且可作為連接遺傳圖譜與物理圖譜間的橋梁而用于基因組的研究。

限制性片段長(cháng)度多態(tài)性(RFLP)分析<

原理是用限制性?xún)惹忻笇⒓毦蚪MDNA進(jìn)行切割,之后在瓊脂糖凝膠上電泳分離,以顯示不同種群基因組DNA的限制性片段長(cháng)度多態(tài)性.RFLP產(chǎn)生的指紋圖譜更適用于細菌種間及種內株間的分型鑒定。

隨機擴增DNA多態(tài)性(RAPD)分析,又稱(chēng)為隨意引物PCR(AP—PCR)

它是一種DNA指紋多態(tài)性分析技術(shù),其理論依據是不同的基因組中與隨意引物匹配的堿基序列的位點(diǎn)和數目可能不同,因而用一組人為設計的核苷酸作為引物,通過(guò)PCR隨機擴增可產(chǎn)生物種特異性的DNA帶譜。

結束語(yǔ)：一般來(lái)說(shuō),對于微生物的檢測或鑒定應當至少使用三種指標同時(shí)進(jìn)行驗證.傳統的分類(lèi)鑒定需要測定的項目眾多,工作程序繁瑣,耗時(shí)長(cháng).在某些時(shí)候可以配合分子生物學(xué)的方法進(jìn)行鑒定,如在進(jìn)行菌株的血清型鑒定時(shí),對于某些國內資源稀缺的菌株定型血清,而進(jìn)口定型血清價(jià)格昂貴,國內可以開(kāi)發(fā)分子生物學(xué)分型方法完成菌株的血清分型工作.而在利用分子生物學(xué)方法鑒定菌株血清型時(shí),經(jīng)常會(huì )遇到有一些菌株的血清型種類(lèi)繁多,目前還無(wú)法通過(guò)簡(jiǎn)單的核酸測定完成血清定型工作,如大腸桿菌,僅O抗原就有上百種血清型,對于這種情況在使用血清進(jìn)行定型的同時(shí),還需要繼續深入研究其分型技術(shù).目前市場(chǎng)上的微生物自動(dòng)鑒定系統雖然基本上都通過(guò)了相關(guān)權威組織的認可,在細菌快速鑒定或初步鑒定中起到了一定的作用,但如前所述,其穩定性尚存在一定問(wèn)題,同樣需要配合其他方法來(lái)相互印證,從而完成細菌鑒定工作。

總而言之,更多地使用傳統與現代相結合以及不斷發(fā)掘新的鑒定方法才能更好地完善菌種保藏過(guò)程中的細菌鑒定工作。

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